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上海抚生探讨人胚胎干细胞分化的材料与方法

2018年09月11日 10:29   新闻资讯

上海抚生实业有限公司 发布 访问商铺

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1.2 主要试剂与仪器

硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)、氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl trimethoxysilane,APTES)、 十六烷基三甲基溴化铵(cetrimoniumbromide, CTAB)、乙醇、***(sodium hydroxide,NaOH)、 四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine,TRITC) 盐酸(hydrochloric acid,HCl)、 抗坏血酸(ascorbic acid,AA)cTnl(ab47003)、FLK-1(ab2349),SOX2(ab97959)及OCT(ab19857)抗体( 购自Abcam公司),ERK1/2、p-ERK1/2、Akt、p-Akt 及PD98059(购自 Cell Signaling Technology),GAPDH 抗体(购自碧云天生物公司),IME-Ⅱ倒置相差显微镜(购自日本Olympus公司),Nikon数码相机和MCV-16BSU超净工作台(购自日本 Sanyo公司),高速离心机3 ~ 18k(购自美国Sigma公司),PCR仪(购自德国 Biometra公司)(PCR Stepone plus)。
1.3 MSN纳米粒子的合成
MSN和荧光包被MSN的制备参考文献,基于两步法微调后制备而成,首先将12μl APTES加入到5.5mg TRITC和3ml 无水乙醇的溶液中,随后在惰性气体中搅拌2h。然后将TRITC-APTES溶液加入2.5 mlTEOS,避光搅拌12h。取另1个容器,将0.5g CTAB溶于240ml 超纯水与1.75ml NaOH(2 mol/L)的溶液中,并在50℃剧烈搅拌。待CTAB溶液的温度稳定后,加入含有TEOS和TRITC-APTES的乙醇溶液,50℃避光搅拌24h。过滤样品并用甲醇洗涤。为了去除颗粒的孔中表面活性剂,将850mg 颗粒分散在90ml甲醇和5ml氢氯酸(12.1 mol/L)的溶液中并回流24h。然后将颗粒过滤,用甲醇充分洗涤,并在室温下干燥。MSN的合成则是省略上述第一步。

1.4 MSN特性

采用光谱仪(Shimadzu UV-2450)测定紫外 -可见吸收光谱。 通过粒度分析仪系统(90 Plus,Brookhaven Instruments)测量MSN的流体动力学尺寸分布特征和ζ 电位。在200kV的加速电压通过JEOL模型JEM-2010透射电子显微镜得到TEM图像。为制备TEM样品,将MSN溶液滴分散在碳涂覆的300目铜格栅(Carbon Type-B, Ted Pella, Inc)上,
将乙酸铀酰溶液(2%,10 μl)滴加到网格上进行阴性染色。

1.5 TMSN与TMSN-AA的合成

将TRITC负载二氧化硅纳米颗粒(TRITCmesoporous silica nanoparticles, TMSN)(50mg)和A(5mg)加入5ml 超纯水中并搅拌24h,然后将混合物以7000r/min 离心10min,弃去上清液。通过使用紫外 - 可见分光光度法,比较原始溶液和上清液的吸光度值,以确定装载在TMSNs内的AA的量。用超纯水超声处理载有药物的TMSN并洗涤2次以除去吸附在表面而不是孔内的AA。TMSN 纳米载体的负载效率为:1 mg/ml,TMSN可负载0.12mg/ml的AA。

1.6 细胞培养

将人胚胎干细胞(hESCs)常规培养于DMEM(Gibco)培养基与Ham's F-12培养基1∶1混合的培养基中,其中含有1.2g/L碳酸氢钠,2.5mmol/L L-谷氨酰胺,15mmol/L 4-羟乙基哌嗉乙碘酸(HEPES),0.5mmol/L丙 酮 酸 钠,0.1mmol/L非必需氨基酸,0.1mmol/L 2-巯基乙醇,4ng/ml bFGF和15%胎牛血清。将hESCs细胞接种在没有饲养层细胞的超低培养板中,37℃、5%二氧化碳CO 2培养箱中培养。


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